四川轻化工大学研究生，四川轻化工大学研究生院官网
大曲作为中国白酒酿造过程中物系、酶系及其菌系的重要载体，为白酒发酵过程提供了丰富的微生物类群、功能酶及其风味物质，保证了糖化和发酵作用同时进行。而酒曲的质量是影响白酒风味品质的重要因素，目前行业内对大曲的质量评价还是多依赖于传统感官指标和一些理化指标，且主要依据感官指标；大曲的感官评价包括外观、断面和香味，理化指标则有发酵力、糖化力、液化力、水分、酸度、淀粉含量等，从而将大曲分为多个等级。
四川轻化工大学生物工程学院的向港兴、黄 丹*等对生产上常用的优级曲和一级曲两种大曲进行分析，利用高通量测序技术比较两种等级大曲的微生物群落结构差异，并对大曲理化指标进行测定，分析其与微生物之间的相关性，以期发现影响大曲质量的微生物因素，为完善大曲评价指标，建立统一的大曲质量评价标准提供理论参考。
1、不同等级大曲微生物群落结构多样性分析
利用各样本在不同测序深度时的微生物Sobs指数构建稀释曲线（图1），随着测序深度的增加，曲线趋于平缓，表明测序量充足，能够覆盖所有样本中的微生物群落。
用标准化的序列进行α多样性分析，得到了细菌和真菌的多样性指数见表2。总体来说，优级曲中的物种丰富度和多样性均高于一级曲，且所有大曲中细菌物种的丰富度和多样性普遍高于真菌物种。从这个结果也可得出，大曲中细菌微生物类群比真菌微生物类群更加丰富，并且高质量大曲相比于低质量大曲有更加丰富的微生物区系。
2、不同等级大曲微生物群落结构分析
在属水平上，根据平均相对丰度，将样品中相对丰度小于0.01的物种归为一类（others），如图2a所示，优级曲和一级曲两组曲样中优势细菌属为高温放线菌属（Thermoactinomyces）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia），这与其他学者的研究结果较为一致。
由图2b可知，两组大曲中真菌物种种类少于细菌，其中嗜热真菌属（Thermomyces）、未分类曲霉科（unclassified_f__Aspergillaceae）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）为两组样品中占比较高的优势物种。在优级曲和一级曲两组曲样中嗜热真菌属相对丰度为34.22%和44.14%，嗜热子囊菌属相对丰度为32.87%和8.42%，嗜热真菌属和嗜热子囊菌属是白酒酿造过程中重要的真菌微生物，已被多次报道在白酒酿造大曲和酒醅中大量存在，该类真菌产生的纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶等酶类具有较高的热稳定性和活力，能够降解代谢原料中的大分子多糖和蛋白质，对白酒酿造过程中微生物的生长繁殖和生香物质的产生有促进作用。
通过对两组大曲在属水平的微生物群落结构比较发现，曲样中优势细菌微生物种类和相对丰度差异不大，其中不同的是一级曲中克罗彭斯特菌属远高于优级曲样品，而优级曲样品中未分类奈瑟球菌科则明显高于一级曲。对于真菌微生物而言，两组大曲中的优势真菌物种没有明显差异，但是不同大曲中优势真菌物种相对丰度有较大差异；在优级曲中嗜热子囊菌属和曲霉属远高于一级曲样品，未分类曲霉科则是一级曲高于优级曲。由此可以看出，两种等级的大曲中优势微生物物种一致，但是相对丰度有着一定差异，细菌优势微生物中克罗彭斯特菌属和真菌优势微生物中的嗜热子囊菌属和霉菌均有较大的差异，这可能也是导致大曲质量存在差异的原因。
3、不同等级大曲差异微生物分析
从图3a、b可以看出，在属水平两组大曲中共检测出9 种差异微生物，线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞3，其中优级曲中差异物种为泰氏菌属（Tissierella）、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、Syntrophaceticus、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）、红球菌属（Rhodococcus）、变形杆菌属（Proteus），一级曲中差异微生物为沙雷氏菌属（Serratia）、g__unclassified_c__Alphaproteobacteria。且优级曲的红球菌属、变形杆菌属、乳球菌属、嗜蛋白菌属、肠球菌属的相对丰度显著高于一级曲（P＜0.05）（图3c）。一级曲中的沙雷氏菌属极显著高于优级曲（P＜0.01），虽然其并未在白酒酿造中体现出功能，但有可能通过微生物的相互作用影响大曲微生物菌群结构；g__unclassified_c__Alphaproteobacteria菌属显著高于优级曲。两组大曲差异细菌微生物中乳球菌属虽然相对丰度低于1%，但是具有水解蛋白和产生特征风味物质的能力，被广泛应用于发酵乳制品中（干酪、酸奶、酸奶油），虽然在白酒酿造过程中的研究报道较少，但是其产酯、酸、酮等风味物质的能力在白酒酿造过程中发挥的作用也值得关注。
图4为两组曲样中真菌物种LEfSe分析和差异显著性检验结果，可知在属水平上，两组大曲中检测出差异物种共有9 种（LDA＞3）。其中优级曲差异微生物为嗜热子囊菌属（Thermoascus）、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉属（Rhizopus）、假丝酵母属（Candida）、Clavispora；一级曲中的差异微生物为耐干霉菌属（Xeromyces）、Phialosimplex、Dipodascus、未分类曲霉科（g__unclassified_f__Aspergillaceae）。优级曲中的嗜热子囊菌属、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉属、假丝酵母属、Clavispora相对丰度均显著高于一级曲，而一级曲中的耐干霉菌属、未分类曲霉科的相对丰度显著高于优级曲。
4、不同等级大曲理化、生化指标的差异
从表3可以看出，两组曲样的水分、总酸含量、pH值均有显著差异，大曲中水分含量主要受到曲房温度、湿度以及微生物生长特别是丝状微生物的影响，而较低水分含量不利于微生物的生长代谢活动，两组大曲的水分均低于13%，其中优级曲水分显著低于一级曲；总酸含量是微生物生长过程中代谢产酸以及脂肪、淀粉和蛋白质降解生成酸类物质的总和，能够在一定程度上表征大曲发酵过程中微生物的生长代谢情况，优级曲的总酸含量显著高于一级曲，pH值则显著低于一级曲，且两组总酸含量均在0.9～1.3 mmol/10 g之间，达到了一级曲质量标准。
5、大曲理化指标与微生物的相关性分析
图5展示了大曲微生物中相对丰度前10的细菌和真菌物种与大曲理化指标之间的关系。细菌中的魏斯氏菌属、乳酸杆菌属、葡萄球菌属和真菌中的嗜热子囊菌属与pH值和发酵力呈正相关，魏斯氏菌属、乳酸杆菌属等这类产酸微生物在大曲中大量存在，可能也是导致优级曲pH值显著低于一级曲的原因，而高温放线菌属、克罗彭斯特菌属与pH值呈负相关，可能的原因是这两类微生物都属于放线菌，更适应于在中性或微碱性的环境中生存，因此在一级曲中这两类微生物的相对丰度均远高于优级曲；而对大曲发酵力而言，由于不管是酵母菌的乙醇发酵还是细菌乙醇发酵，乙醇的产生都是通过丙酮酸脱羧成乙醛后被还原为乙醇，即乙醇和CO2具有伴生关系，因此大曲发酵力是以大曲中微生物产CO2的量表征。
结 论
对优级曲和一级曲两种等级大曲的微生物群落结构与理化指标进行了比较分析，并结合数理分析法研究了微生物与理化指标之间的关系。通过对两种等级大曲的微生物群落结构进行分析，结果表明两种大曲的优势物种基本一致，但是物种间的相对丰度有较大差异；经LEfSe分析并结合Wilcoxon秩和检验，结果发现两种等级的大曲之间的细菌差异微生物均为样品中的低丰度物种，而真菌差异微生物中的、未分类曲霉科为大曲中优势物种，且相对丰度具有显著差异；理化分析结果表明，两种等级的大曲理化性质除了发酵力外均有显著差异，结合RDA发现乳酸杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属与总酸含量和发酵力呈正相关。这些结果说明了不同等级大曲的优势微生物相对丰度存在较大差异，且理化指标之间也存在显著差异，特别是嗜热子囊菌属和未分类曲霉科在两种等级大曲中的相对丰度差异显著，与大曲的理化性质息息相关，而大曲中这些优势真菌微生物的显著差异可能就是影响大曲质量的重要微生物因素。前述结论表述了对大曲质量有重要影响的微生物类群，为进一步完善大曲评价指标，建立浓香型大曲质量评价标准提供了理论参考。
01
通信作者简介
黄丹，教授，四川轻化工大学生物工程学院，四川省生物工程类专业教指委委员、中国微生物学会会员、四川省微生物学会理事、宜宾市酒类协会第五届副会长、轻工行业职业能力评价质量监督员。长期从事微生物学、食品发酵分析等教学工作，主要开展白酒酿造、调味品生产、农产品精深加工等科研工作。近三年，在 Bioresource Technology、 Food Research International、 Food Chemistry、 LWT – Food Science and Technology、《食品科学》等期刊发表论文十余篇，获得四川省科技进步二等奖1项，授权专利十余项。
02
第一作者简介
向港兴，四川轻化工大学生物工程学院酿酒工程专业硕士研究生，主要研究方向为酿酒生物技术及应用， 《食品科学》发表一篇文章。
本文《不同等级浓香型大曲微生物群落结构与理化性质的比较分析》来源于《食品科学》2022年43卷18期184-191页，作者：向港兴，陈莹琪，沈毅，王西，张亚东，罗惠波，黄丹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211018-193。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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